據與達．芬奇同時期的傳記作家瓦薩裡記載：“蒙娜.麗莎”是佛羅倫薩一位皮貨商的妻子，達.芬奇畫她的時侯(1503年畫起)，她年僅二十四歲，這位婦女剛失去了自己心愛的女兒，常常悲哀抑鬱。畫家在畫她的肖像時，為了讓她面露微笑，想出種種辦法：請樂師給她奏樂，唱歌，或說笑話，讓歡快的氣氛幫助她展現笑容。

畫上的蒙娜麗莎呈現的笑容雖是微弱的，但可以從她的眉宇間看出內心的愉悅，一絲微笑似乎剛從她的臉上掠過。稍翹起的嘴角和舒展的笑肌，可以讓人微微感覺到這位婦人在被畫的時刻的心情。她那安詳的儀態，表明她的微笑是平靜的，這是一種古代婦女的矜持的美的表現。由於蒙娜.麗莎的微笑顯得富有魅力，不少美述史家稱它為“神秘的微笑”。
　　
在構圖上，達.芬奇改變了以往肖像畫多採用側面半身或截至胸部的習慣，代之以正面的胸像構圖，透視點略微上，使構圖呈金字塔型。這樣，“蒙娜.麗莎”就顯得更加端莊和穩重。
　　
“蒙娜麗莎”的雙手被畫得那麼精確、豐滿，完全符合解剖結構，展示了她的性格，她的溫柔。從這雙手可以看出，達.芬奇的精湛畫技和他觀察自然的敏銳性。“蒙娜.麗莎”沒有華麗的服，一條深褐色的頭紗上，也不帶任何裝飾品；衣纊的自然褶襞被畫得很仔細。

在背景處理上，達芬奇運用的是“空氣透視法”，把後面的山崖、小徑、石橋、樹叢與潺潺的流水，都推向了遙遠的深處，仿佛這一切都被籠罩在簿霧裡，以此來加強“蒙娜麗莎”形象的地位。這樣一幅不大的肖像畫(77*53cm)竟用去他四年的時間。