大约从1495开始，达芬奇致力于《最后的晚餐》的制作。这件达芬奇最具代表性和开创性的成熟完美的作品，位于米兰圣玛利亚感恩修道院中修士用膳的食堂内 。画面长八米八零，高四米六零。虽然完成不久之后画面就开始剥落，以致后人一直无法看清真貌，即便如此，其构思的精妙、形式的完美、人物肢体语言的生动所表现出戏剧性的张力和人内心状态，都令后人难以望其项背。
主题
《最后的晚餐》在中世纪绘画中原是属于《耶稣受难》题材中的一个片断，到了文艺复兴时期才成为独立的绘画主题。
在不同版本的福音书中，对《最后的晚餐》 的描述不外几个重点﹕一是耶稣宣告自己将被在场的门徒之一出卖，众门徒震惊，纷纷询问是否自己；二是，耶稣手指着（分配）面包和酒进行了圣餐仪式；三是耶稣正在宣告将被出卖时，犹大和耶稣的手正同时沾在盘中（路加福音说放在桌上），此为揭露其叛徒身份的一个信号。
达芬奇将上述情节结合综合呈现在一个画面中，各个单一事件同时相互交错。然而达芬奇最想强调的还是故事中戏剧性的一刻，也就是当耶稣向门徒宣布﹕‘你们当中有一人要出卖我’的当下，十二门徒的各自不同反应。
构图
达芬奇没有像过去画家那样，把犹大孤立在众人和餐桌的对面 ，也没有用光环来区别圣徒与叛徒 ，而是将所有的人安排在餐桌的一边面对观众，这样便于展示每个人物的动作和神态；同时也反映了现实世界的《迷》﹕常人从表像是看不出圣贤与恶徒的差异的。
为了达到写实效果，达芬奇经过精密的计算，使画面的透视正好结合了食堂的结构 ，同时使画面光源和食堂的采光一致，这样看来就像食堂延伸出去的另一个空间一样。
画面采用了左右对称的一点透视，视点（消失点）落在中央耶稣的头部，十二个门徒分列两侧，形成稳重而宾主分明的架构。反应激烈的门徒们虽然动作互异，但是在达芬奇巧妙的安排下，每三人成一群组，群组之间又以肢体动作互相连结、牵引，形成连续中疏密变化、错落有致的视觉韵律感。中央的耶稣看似孤立，但众门徒或手势指向耶稣，或眼神投向耶稣，形成一种向中心集中的力量，保证了画面的统一性和紧凑的整体感，这正是美学《多样的统一》的最佳典范。远观整体，画面平稳庄严又富于变化；近赏局部，则人物神态和静物都栩栩如生、历历在目。
那么达芬奇的难题是:如何在一排人群中表现出犹大的特殊身份呢？
以肢体语言表现内心状态
根据瓦萨利的艺术家列传记载，达芬奇经常在广场和街道上闲逛，以观察各种形形色色的人的行为。达芬奇在《论绘画》中也写道﹕‘一个好的画家应该画好两样主要的东西﹕人和人的心灵意向。…绘画中最重要的事是人物的体态应表现出他的内心状态，如渴望、鄙视、愤怒和同情等等。…’所以达芬奇笔下每个人物都是有情感、有思想的。为了达到这个目地，他也建议画家应该随身带着速写本，以便‘…把人们谈话与争执的神态与动作记录下来，要以极快的笔触画在速写本上。…保留这些速写，作为你探索形式的参考。’事实上这也正是达芬奇自己平时的习惯。可以想像，长久以来一直在观察人们言谈举止和心理关系的达芬奇，在创作《最后的晚餐》时已经累积了可观的经验。
因此达芬奇在构思全局的同时，也在揣摩每个不同性格和背景的人物可能有的外貌、神情和动作反应等，以及人物之间的互动关系。他特别强调用各种手势来描绘耶稣和门徒们当时的心理状态。因为达芬奇认为﹕‘手和手臂的各种动作应显示其运动的思想意图。人只要有同理判断，看到画中的动作就能理解动作者的内心意向。’
《最后的晚餐》中，人物的手势起了视觉导向的作用，强化了画面的统一性；更重要的是这些肢体语言贴切表现了人物的内心意向。达芬奇也借此点出了犹大的身份。
耶稣展开双臂成一金字塔形，表现出平静、坦然、宽容又无奈的神情；和两旁骚动的圣徒们形成对比。
嫉恶如仇的圣彼得向前抓住（耶稣身旁）约翰的肩膀，要他问清楚是谁 出卖耶稣，无意间却把手中抓着钱袋，紧张回头的叛徒犹大推了出来 — 这是达芬奇突出叛徒犹大的方式之一。耶稣右边的老雅各手向两旁一挥，似乎要身后急欲表达清白的多马和菲力安静下来。最左边的三人中，离耶稣最远的巴托缪扶案起身彷佛想听清楚，小雅各伸手想叫回彼得，安德列则双手比划着要大家冷静，三人视线却一致寻向耶稣；而最右三人中，马太、达太和西门激烈讨论著，手也不约而同地都指向画面中央的耶稣。
达芬奇还以其他方式了点出犹大的叛徒身份﹕犹大是画中唯一不与他人互动的人（也是一种孤立的状态），他只是疑惧地看着耶稣，和耶稣一样是静态的，但因为心虚和自我保护的心态而身体向后退，形成了和其他人的对比﹕众门徒都是向心（中央的耶稣）的，而他是离心的；再则是犹大一手抓着犯罪证据 — 钱袋，另一只放在桌上的手正伸向盘子，印证路加福音所述《和耶稣一起沾手在盘子里的人》。此外，犹大的脸部被有意画得晦暗，显示他是有罪之人。有了这些线索，细心的观众不难分辨出叛徒是谁。
在达芬奇之前，还没有哪个画家能把人类的内心活动和肢体语言之间的关系刻画的如此成功。这完美构思从空间的架构、人物的安排、肢体动作的互动、性格与表情…一切布局都在周密的考虑之中，无懈可击。可贵的是达芬奇也没有忽视写实的品质。根据瓦萨利的描述﹕《画中每个细部都精巧得让人难以相信，即使桌上亚麻布的质感，也细腻得不能再真。》
达芬奇的工作态度
达芬奇创作时的研究精神和追求完美的态度众所周知。为了重现《最后的晚餐》当时的场景，达芬奇对耶稣时代的生活习惯、餐具进行考证，请教了宗教中的相关学者。创作时，达芬奇全更是心全意的投入，这一点在他同时代的意大利作家马提奥．班杰洛的回忆录上，有如下生动的描述﹕《达芬奇习惯于一大早就爬上脚手架，从太阳升起到夜幕低垂，画笔从未离手，甚至到废寝忘食的地步。有时他三四天不动一笔，面对壁画凝神发呆，一站一、两个小时，对画出的形象审视思考良久。有时候中午时分，烈日当空，我也曾看到他从议会大厦跑出来，直奔修道院，爬上鹰架，为的只是给某个部位添加上一两笔。》这说明了达芬奇当时即使身在他处，心中还一直在惦记着创作。
技法
追求完美的达芬奇有一再的修改画的习惯。而传统的湿壁画（意大利Fresco，法Fresque）是直接画在未干的泥灰上，必须每天按一定的面积份量快速的画，但是一旦完成后就很难改动。这对达芬奇来说很不方便，于是在创作《最后的晚餐》时，他就想改良壁画的配方和技术，使得壁画在完成后还能修改。他采用新的溶剂调和方法，用油彩和蛋彩混合在上了两次底层的干灰泥墙面画，如同一般木板画一样的处理法。可惜这种方法用在壁画就不管用，反而成了后来壁画很快剥落的主要原因。
可能墙面受潮的缘故，《最后的晚餐》从1500年就开始损坏了，二十年后壁画开始剥落， 此后世世代代都在为修复这伟大而脆弱的艺术瑰宝而伤透脑筋。1977曾以新技术翻修部分。1980年，为了进一步保护古迹，专家用新技术大面积的术清除长年由于空气污染造成的尘垢。这次争议的修复法除去了所有后人在破损部分添加的颜料，据称只留下达芬奇本人最初的笔迹。
《最后的晚餐》无疑是绘画史上最有名、最重要的名作之一，作品面世后立刻博得世人一致的赞誉，达芬奇再次名满天下。这件作品以完美的结构、精辟的人性刻画和生动的戏剧效果，成为后辈竞相学习和模仿的范本，从摹本的普遍程度就可以知道其影响力之大。法军攻占米兰时，法王路易十二甚至想尽办法要将整面墙壁完整带回法国，结果因为难度太高而作罢。
1943年二次大战期间，食堂曾经遭到轰炸倒塌，却唯独这面绘制了《最后的晚餐》的墙壁幸运地在沙包和防护帘幕的保护下留存了下来。当然世间没有偶然的事情，就如同许多上古文明的完美艺术古迹一样，上天似乎有意地保留了这些珍贵的艺术遗产，好让后世在变异的现代艺术中有所参照，走回神传艺术的正统之路。@*
（注1）‘摩尔人’路德维克继承大公爵位后，决定将圣玛利亚感恩修道院作为史佛札家族灵寝的所在。这可能是达芬奇接受此项任务的背景。
（注2）马太福音26章17-30节、约翰福音13章21-35节…《耶稣和门徒们继续吃晚餐，耶稣这时预言门徒中有一人要出卖他。 门徒们就很忧愁，深怕自己是那个出卖耶稣的人，纷纷问耶稣：“主啊，是 我吗？”“是我吗？” 有一个耶稣深爱的门徒，贴近耶稣的胸膛问：“主阿，是谁呢？” 耶稣回答说：“现在和我一起沾手在盘子里的那人就是。”他指的就是犹大 。而这出卖耶稣的犹大，还是靠到耶稣身上，问：“主啊，是我吗？”耶稣回答 ：“正是你。你想要做什么，就快去做吧！”犹大就出去了，其他门徒还以为耶稣是叫他去买过节要用的东西呢。…》
（注3）在达芬奇之前，佛罗伦斯的画家如安德列．卡斯塔纽和吉兰达忧等都曾经画过这个主题。卡斯塔纽（Andrea del Castagno）于1450年所画的《最后的晚餐》在圣阿波隆尼亚教堂的食堂内；吉兰达忧（Domenico Ghillandaio）1480年在奥格尼桑提女修道院中绘制了同样题材。他们的构图都是使耶稣和众门徒沿长桌坐在一侧，而让犹大背对观众，隔着餐桌坐在对面。
（注4）可能因为《写实》观念的影响，达芬奇在绘制《岩窟圣母》时就省略了人物和天使头上的光；达芬奇在《最后的晚餐》中也并未画出耶稣和门徒的光环，仅以中央后方的户外光和窗上的拱形暗示耶稣的光环。而过去的画家在处理这个题材时，犹大是众人中唯一头上没有光环的。
（注5）如果观者站在离地四公尺的高度（也是达芬奇画画时的视点高度），画面看来完全像是实际建筑的延伸。文艺复兴画家经常用透视法制造假想的空间深远效果。
（注6）过去约翰福音(13:24)描述耶稣钟爱的年轻使徒约翰，闻言倒在耶稣怀中哭泣，彼得向他招手示意他问耶稣说的是谁。达芬奇在此则突显圣彼得的冲动性格﹕彼得气势汹汹地身体向前，一手握餐刀，一手抓住约翰。
（注7）十二门徒和耶稣从左到右依序是﹕巴托缪、小雅各、安德列、犹大、彼得、约翰、耶稣、汤玛斯、大雅各、菲力浦、马太、达太、西门。(Bartholomew, James the Less, Andrew, Judas, Peter, John, Christ, Thomas, James the Greater, Philip, Matthew, Thaddeus, Simon.)
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