大約從1495開始，達芬奇致力於《最後的晚餐》的製作。這件達芬奇最具代表性和開創性的成熟完美的作品，位於米蘭聖瑪利亞感恩修道院中修士用膳的食堂內 。畫面長八米八零，高四米六零。雖然完成不久之後畫面就開始剝落，以致後人一直無法看清真貌，即便如此，其構思的精妙、形式的完美、人物肢體語言的生動所表現出戲劇性的張力和人內心狀態，都令後人難以望其項背。
主題
《最後的晚餐》在中世紀繪畫中原是屬於《耶穌受難》題材中的一個片斷，到了文藝復興時期才成為獨立的繪畫主題。
在不同版本的福音書中，對《最後的晚餐》 的描述不外幾個重點﹕一是耶穌宣告自己將被在場的門徒之一出賣，眾門徒震驚，紛紛詢問是否自己；二是，耶穌手指著（分配）麵包和酒進行了聖餐儀式；三是耶穌正在宣告將被出賣時，猶大和耶穌的手正同時沾在盤中（路加福音說放在桌上），此為揭露其叛徒身份的一個信號。
達芬奇將上述情節結合綜合呈現在一個畫面中，各個單一事件同時相互交錯。然而達芬奇最想強調的還是故事中戲劇性的一刻，也就是當耶穌向門徒宣佈﹕『你們當中有一人要出賣我』的當下，十二門徒的各自不同反應。
構圖
達芬奇沒有像過去畫家那樣，把猶大孤立在眾人和餐桌的對面 ，也沒有用光環來區別聖徒與叛徒 ，而是將所有的人安排在餐桌的一邊面對觀眾，這樣便於展示每個人物的動作和神態；同時也反映了現實世界的《迷》﹕常人從表像是看不出聖賢與惡徒的差異的。
為了達到寫實效果，達芬奇經過精密的計算，使畫面的透視正好結合了食堂的結構 ，同時使畫面光源和食堂的採光一致，這樣看來就像食堂延伸出去的另一個空間一樣。
畫面採用了左右對稱的一點透視，視點（消失點）落在中央耶穌的頭部，十二個門徒分列兩側，形成穩重而賓主分明的架構。反應激烈的門徒們雖然動作互異，但是在達芬奇巧妙的安排下，每三人成一群組，群組之間又以肢體動作互相連結、牽引，形成連續中疏密變化、錯落有致的視覺韻律感。中央的耶穌看似孤立，但眾門徒或手勢指向耶穌，或眼神投向耶穌，形成一種向中心集中的力量，保證了畫面的統一性和緊湊的整體感，這正是美學《多樣的統一》的最佳典範。遠觀整體，畫面平穩莊嚴又富於變化；近賞局部，則人物神態和靜物都栩栩如生、歷歷在目。
那麼達芬奇的難題是:如何在一排人群中表現出猶大的特殊身份呢？
以肢體語言表現內心狀態
根據瓦薩利的藝術家列傳記載，達芬奇經常在廣場和街道上閒逛，以觀察各種形形色色的人的行為。達芬奇在《論繪畫》中也寫道﹕『一個好的畫家應該畫好兩樣主要的東西﹕人和人的心靈意向。…繪畫中最重要的事是人物的體態應表現出他的內心狀態，如渴望、鄙視、憤怒和同情等等。…』所以達芬奇筆下每個人物都是有情感、有思想的。為了達到這個目地，他也建議畫家應該隨身帶著速寫本，以便『…把人們談話與爭執的神態與動作記錄下來，要以極快的筆觸畫在速寫本上。…保留這些速寫，作為你探索形式的參考。』事實上這也正是達芬奇自己平時的習慣。可以想像，長久以來一直在觀察人們言談舉止和心理關係的達芬奇，在創作《最後的晚餐》時已經累積了可觀的經驗。
因此達芬奇在構思全局的同時，也在揣摩每個不同性格和背景的人物可能有的外貌、神情和動作反應等，以及人物之間的互動關係。他特別強調用各種手勢來描繪耶穌和門徒們當時的心理狀態。因為達芬奇認為﹕『手和手臂的各種動作應顯示其運動的思想意圖。人只要有同理判斷，看到畫中的動作就能理解動作者的內心意向。』
《最後的晚餐》中，人物的手勢起了視覺導向的作用，強化了畫面的統一性；更重要的是這些肢體語言貼切表現了人物的內心意向。達芬奇也藉此點出了猶大的身份。
耶穌展開雙臂成一金字塔形，表現出平靜、坦然、寬容又無奈的神情；和兩旁騷動的聖徒們形成對比。
嫉惡如仇的聖彼得向前抓住（耶穌身旁）約翰的肩膀，要他問清楚是誰 出賣耶穌，無意間卻把手中抓著錢袋，緊張回頭的叛徒猶大推了出來 — 這是達芬奇突出叛徒猶大的方式之一。耶穌右邊的老雅各手向兩旁一揮，似乎要身後急欲表達清白的多馬和菲力安靜下來。最左邊的三人中，離耶穌最遠的巴托繆扶案起身彷佛想聽清楚，小雅各伸手想叫回彼得，安德列則雙手比劃著要大家冷靜，三人視線卻一致尋向耶穌；而最右三人中，馬太、達太和西門激烈討論著，手也不約而同地都指向畫面中央的耶穌。
達芬奇還以其他方式了點出猶大的叛徒身份﹕猶大是畫中唯一不與他人互動的人（也是一種孤立的狀態），他只是疑懼地看著耶穌，和耶穌一樣是靜態的，但因為心虛和自我保護的心態而身體向後退，形成了和其他人的對比﹕眾門徒都是向心（中央的耶穌）的，而他是離心的；再則是猶大一手抓著犯罪證據 — 錢袋，另一隻放在桌上的手正伸向盤子，印證路加福音所述《和耶穌一起沾手在盤子裏的人》。此外，猶大的臉部被有意畫得晦暗，顯示他是有罪之人。有了這些線索，細心的觀眾不難分辨出叛徒是誰。
在達芬奇之前，還沒有哪個畫家能把人類的內心活動和肢體語言之間的關係刻畫的如此成功。這完美構思從空間的架構、人物的安排、肢體動作的互動、性格與表情…一切佈局都在周密的考慮之中，無懈可擊。可貴的是達芬奇也沒有忽視寫實的品質。根據瓦薩利的描述﹕《畫中每個細部都精巧得讓人難以相信，即使桌上亞麻布的質感，也細膩得不能再真。》
達芬奇的工作態度
達芬奇創作時的研究精神和追求完美的態度眾所周知。為了重現《最後的晚餐》當時的場景，達芬奇對耶穌時代的生活習慣、餐具進行考證，請教了宗教中的相關學者。創作時，達芬奇全更是心全意的投入，這一點在他同時代的義大利作家馬提奧．班傑洛的回憶錄上，有如下生動的描述﹕《達芬奇習慣於一大早就爬上腳手架，從太陽升起到夜幕低垂，畫筆從未離手，甚至到廢寢忘食的地步。有時他三四天不動一筆，面對壁畫凝神發呆，一站一、兩個小時，對畫出的形象審視思考良久。有時候中午時分，烈日當空，我也曾看到他從議會大廈跑出來，直奔修道院，爬上鷹架，為的只是給某個部位添加上一兩筆。》這說明了達芬奇當時即使身在他處，心中還一直在惦記著創作。
技法
追求完美的達芬奇有一再的修改畫的習慣。而傳統的濕壁畫（義大利Fresco，法Fresque）是直接畫在未乾的泥灰上，必須每天按一定的面積份量快速的畫，但是一旦完成後就很難改動。這對達芬奇來說很不方便，於是在創作《最後的晚餐》時，他就想改良壁畫的配方和技術，使得壁畫在完成後還能修改。他採用新的溶劑調和方法，用油彩和蛋彩混合在上了兩次底層的乾灰泥牆面畫，如同一般木板畫一樣的處理法。可惜這種方法用在壁畫就不管用，反而成了後來壁畫很快剝落的主要原因。
可能牆面受潮的緣故，《最後的晚餐》從1500年就開始損壞了，二十年後壁畫開始剝落， 此後世世代代都在為修復這偉大而脆弱的藝術瑰寶而傷透腦筋。1977曾以新技術翻修部分。1980年，為了進一步保護古跡，專家用新技術大面積的術清除長年由於空氣污染造成的塵垢。這次爭議的修復法除去了所有後人在破損部分添加的顏料，據稱只留下達芬奇本人最初的筆跡。
《最後的晚餐》無疑是繪畫史上最有名、最重要的名作之一，作品面世後立刻博得世人一致的讚譽，達芬奇再次名滿天下。這件作品以完美的結構、精闢的人性刻畫和生動的戲劇效果，成為後輩競相學習和模仿的範本，從摹本的普遍程度就可以知道其影響力之大。法軍攻佔米蘭時，法王路易十二甚至想盡辦法要將整面牆壁完整帶回法國，結果因為難度太高而作罷。
1943年二次大戰期間，食堂曾經遭到轟炸倒塌，卻唯獨這面繪製了《最後的晚餐》的牆壁幸運地在沙包和防護簾幕的保護下留存了下來。當然世間沒有偶然的事情，就如同許多上古文明的完美藝術古蹟一樣，上天似乎有意地保留了這些珍貴的藝術遺產，好讓後世在變異的現代藝術中有所參照，走回神傳藝術的正統之路。@*
（註1）『摩爾人』路德維克繼承大公爵位後，決定將聖瑪利亞感恩修道院作為史佛札家族靈寢的所在。這可能是達芬奇接受此項任務的背景。
（註2）馬太福音26章17-30節、約翰福音13章21-35節…《耶穌和門徒們繼續吃晚餐，耶穌這時預言門徒中有一人要出賣他。 門徒們就很憂愁，深怕自己是那個出賣耶穌的人，紛紛問耶穌：「主啊，是 我嗎？」「是我嗎？」 有一個耶穌深愛的門徒，貼近耶穌的胸膛問：「主阿，是誰呢？」 耶穌回答說：「現在和我一起沾手在盤子裏的那人就是。」他指的就是猶大 。而這出賣耶穌的猶大，還是靠到耶穌身上，問：「主啊，是我嗎？」耶穌回答 ：「正是你。你想要做什麼，就快去做吧！」猶大就出去了，其他門徒還以為耶穌是叫他去買過節要用的東西呢。…》
（註3）在達芬奇之前，佛羅倫斯的畫家如安德列．卡斯塔紐和吉蘭達憂等都曾經畫過這個主題。卡斯塔紐（Andrea del Castagno）於1450年所畫的《最後的晚餐》在聖阿波隆尼亞教堂的食堂內；吉蘭達憂（Domenico Ghillandaio）1480年在奧格尼桑提女修道院中繪製了同樣題材。他們的構圖都是使耶穌和眾門徒沿長桌坐在一側，而讓猶大背對觀眾，隔著餐桌坐在對面。
（註4）可能因為《寫實》觀念的影響，達芬奇在繪製《岩窟聖母》時就省略了人物和天使頭上的光；達芬奇在《最後的晚餐》中也並未畫出耶穌和門徒的光環，僅以中央後方的戶外光和窗上的拱形暗示耶穌的光環。而過去的畫家在處理這個題材時，猶大是眾人中唯一頭上沒有光環的。
（註5）如果觀者站在離地四公尺的高度（也是達芬奇畫畫時的視點高度），畫面看來完全像是實際建築的延伸。文藝復興畫家經常用透視法製造假想的空間深遠效果。
（註6）過去約翰福音(13:24)描述耶穌鍾愛的年輕使徒約翰，聞言倒在耶穌懷中哭泣，彼得向他招手示意他問耶穌說的是誰。達芬奇在此則突顯聖彼得的衝動性格﹕彼得氣勢洶洶地身體向前，一手握餐刀，一手抓住約翰。
（註7）十二門徒和耶穌從左到右依序是﹕巴托繆、小雅各、安德列、猶大、彼得、約翰、耶穌、湯瑪斯、大雅各、菲力浦、馬太、達太、西門。(Bartholomew, James the Less, Andrew, Judas, Peter, John, Christ, Thomas, James the Greater, Philip, Matthew, Thaddeus, Simon.)
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