大約在1507-08年，法王路易十二委託達芬奇將《聖安娜》草圖再修改完成，因為法王想要以此畫獻給他名叫安娜的第二任妻子。因此達芬奇重拾1501年的構圖，開始以油畫著手《聖母子和聖安娜》，可惜這件作品一直到他臨終時尚未全部完成，目前收藏於盧浮宮。
這幅《聖母子、聖安娜和施洗約翰》構思和前述《伯靈頓學院大型草圖》相近，但題材上更接近達芬奇1501年在佛羅倫斯繪製的那一幅，因為達芬奇以羔羊代替了施洗約翰的位置。
圖中人物的安排更加集中，形成一個以安娜為頂點的三角形構圖。為了達到這個結構，達芬奇甚至讓瑪利亞不合常理的疊坐在安娜腿上，使二人緊密結合成的重心有力的凝聚了畫面，平衡著畫面聚、散兩種力量— 左邊的聖安娜、瑪利亞和右邊的聖嬰和羔羊。人物的安排十分特別﹕安娜懷中坐著瑪利亞，而瑪利亞向前欲意抱回聖嬰，聖嬰則緊抓著象徵犧牲的羔羊﹕四個人物成串似的一個抱著一個，而其中卻包含了嚴肅的宗教意涵和複雜的人類情感。抱著羔羊的年幼耶穌儼然已經義無反顧地選擇了為人受難的未來；身體前傾意欲拉回孩子的瑪利亞表現出作為慈母的人性，似乎不忍孩子犧牲的命運而意圖阻止。聖安娜安詳而超然地望著眼前的景象，她的容貌令人想起蒙娜麗莎，臉上微笑卻是歡喜而慈悲的。
從聖母的衣袍和手部的簡略來看，作品顯然尚未完成。背景仍然採用了空氣遠近法，除了右後方的一棵樹之外，達芬奇嘗試以單純化的素材—山岩結構和水流—來營造背景空間，結果造就了一個變化豐富、層次分明、山川氤氳的世界（只是略顯荒涼），乍看之下頗像中國山水畫。不論這幅《聖安娜》油畫，還是前述的《伯靈頓草圖》，其巧思都間接印證了達芬奇1501年在佛羅倫創作的草圖之所以引起轟動是有道理的。
1510年左右，達芬奇構思了以希臘神話為主題的《麗達與天鵝》（1510-15），在他的筆記中可見到完整的草圖和麗達髮式的習作。可惜達芬奇的原作已經遺失，目前流傳下來的幾幅油畫只是學生和後人的仿作。
在米蘭期間，達芬奇也結識了兩個對他影響深遠的年輕人，一是為達芬奇的解剖研究開啟了新方向的帕維亞大學解剖學教授托爾（Marcantonio della Torre）；一個是房東兒子也是年輕畫家的梅濟（Francesco Melzi），後來成為達芬奇的入室弟子，並在他晚年如親人般照顧他，繼承了他的大量手稿。
達芬奇在1511年受米蘭傭兵吉安．特里夫吉歐 （Gian G.Trivulzio）之托製作一座騎馬雕像。不過這件作品又因為1512年米蘭遭瑞士、西班牙、威尼斯和教宗國組成的聯軍攻入而無法繼續。法國人被逐的同時，達芬奇也再次失去了雇主。而此時已經六十歲的達芬奇，亟需一個安定的生活和穩定的收入。所幸在1513年達芬奇受教宗邀請，一行人離開米蘭前往羅馬。@*
(http://www.dajiyuan.com)
